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Una recente ricerca italiana si è proposta l'identificazione e la validazione di miRNA che siano predittivi di una estensione di malattia del carcinoma della laringe e della risposta ai trattamenti.

Abstract 

I microRNA sono piccoli RNA non codificanti che regolano l’espressione genica a livello post-trascrizionale attraverso meccanismi di inibizione della traduzione.

Nell’ultima decade i microRNA sono stati implicati in vari processi biologici di potenziale interesse oncologico. La deregolazione dei miRNA ha un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella progressione dei tumori attraverso alterazioni dell’espressione di geni chiave in processi quali apoptosi, differenziamento e rimodellamento tissutale. 

Diversi microRNA sono implicati nella genesi dei tumori agendo da oncogeni o da oncosoppressori, pertanto possono essere sia ipo che iper-espressi nei tumori umani rispetto alla loro controparte normale ed alcuni di essi possono essere marcatori diagnostici e prognostici. Rispetto agli altri marcatori molecolari di neoplasie, un sicuro vantaggio dei miRNA è legato al fatto che essi sono presenti nel tessuto tumorale e sono secreti in tutti i fluidi biologici dell’organismo compreso sangue e saliva. Questo permette di determinarne l’espressione in maniera incruenta o dal sangue dei pazienti o addirittura dalla saliva e di effettuare il monitoraggio sia su popolazione sana (in caso dei marcatori diagnostici) che su popolazione affetta da neoplasia (in caso di marcatori prognostici e predittivi di risposta e di estensione di malattia) in maniera rapida e del tutto incruenta. Lo studio si propone l'identificazione e la validazione di miRNA che siano predittivi di estensione di malattia del carcinoma della laringe (coinvolgimento linfonodale ed estensione TNM di malattia), distal marker, e di predizione di risposta ai trattamenti (chirurgia e radioterapia). Nel caso di progressione di malattia viene  valutata anche la correlazione di tali marcatori con la risposta ai trattamenti chemioterapici. A tal fine sono stati raccolti campioni tissutali, saliva e siero di 220  pazienti sottoposti ad intervento di laringectomia e provenienti da diversi centri campani. Tali tessuti sono tutti criopreservati presso la banca Biologica del Dipartimento di Medicina di Precisione della Università della Campania “L. Vanvitelli” e sono integrati da tutti i dati clinici e di follow up dei pazienti (sopravvivenza globale e libera da malattia, eventuali trattamenti concomitanti o successivi radianti e/o medici, recidiva, associazione con HPV, altre co-morbidità, etilismo, staging e grading della neoplasia, notizie anatomopatologiche complete e sito di origine della neoplasia)

Introduzione

I tumori della testa e del collo e il carcinoma della laringe

La mortalità associata a carcinomi squamosi testa-collo (HNSCC) è ancora inaccettabilmente alta e rimane tra le più alte dei principali tumori solidi. Nonostante i miglioramenti nel controllo locale della HNSCC, molti pazienti continuano a morire di questa malattia a causa dello sviluppo di metastasi a distanza. Nel cancro orale la percentuale di sopravvivenza a 5 anni è solo il 17% per i pazienti con metastasi a distanza, rispetto a oltre il 80% per quelli con lesioni localizzate.  

Tra gli HNSCC il carcinoma squamocellulare della laringe (LSCC) rappresenta circa il 2% di tutti i tumori, con un’incidenza nel 2012 di 39.900 nuovi casi su 100.000 abitanti, ed un rapporto maschio: femmina pari a 8,8: 0,8 (9: 0,7 in Italia). È considerato, per incidenza, la neoplasia di più frequente riscontro dell’apparato respiratorio, dopo il carcinoma polmonare. 

La mortalità stimata per il LSCC è pari a 19.800 casi/ 100.000 nel 2012 in Europa, con rapporto maschio: femmina pari a 4,3: 0,3 ( 3,3: 0,8 in Italia).

La sopravvivenza specifica per malattia del cancro della laringe è condizionata da molteplici fattori prognostici; la presenza di metastasi linfonodali laterocervicali rappresenta il singolo fattore prognostico più importante. La sopravvivenza a 2 anni nei pazienti pN+ decresce del 40-50% (88.01% nei pN0 vs 41.54% nei pN+).

Non esistono, al momento, validi fattori predittivi che possano guidare in modo sistematico la scelta del trattamento linfonodale nel carcinoma della laringe. È opinione concorde in letteratura che i marker biomolecolari e soprattutto i microRNA possano colmare tale carenza.

I Micro-RNA: biomarcatori molecolari circolanti

La deregolazione dei miRNA ha un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella progressione dei tumori attraverso alterazioni dell’espressione di geni chiave in processi quali apoptosi, differenziamento e rimodellamento tissutale. I microRNA sono piccoli RNA non codificanti che regolano l’espressione genica a livello post trascrizionale attraverso meccanismi di degradazione del messaggero (presenti solo nei vegetali ed insetti) o di semplice sequestro con inibizione della traduzione (meccanismo presente negli esseri umani).

Una caratteristica importante dei microRNA è la loro capacità di intervenire simultaneamente in diversi pathways attraverso la contemporanea interazione con più messaggeri bersaglio. Attualmente sono molti gli studi che dimostrano il ruolo chiave dei microRNA nella genesi, progressione e capacità metastatica dei tumori. 

Diversi microRNA sono implicati nella tumorigenesi agendo da oncogeni o da oncosoppressori, pertanto la loro espressione nei tessuti tumorali, rispetto ai tessuti sani, può rivelarsi ipo o iper espressa.

La scoperta che i microRNA sono frequentemente deregolati nelle neoplasie, offre l’opportunità di identificarli come marcatori prognostici e diagnostici.

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di effettuare uno studio multicentrico per ricercare un profilo di espressione di microRNA in tessuti derivanti da carcinoma laringeo al fine di identificare specifici microRNA deregolati quali potenziali biomarcatori prognostici indicativi di maggiore aggressività del tumore e di maggiore probabilità di metastatizzazione linfonodale.

microRNA e Cellule staminali tumorali

L'identificazione delle cellule staminali tumorali (CSC), la sottopopolazione di cellule altamente cancerogene nei tumori umani ha creato una nuova area  di ricerca con applicazioni promettenti nella prognosi e terapia. La caratterizzazione di sottopopolazioni tumorali CSC in HNSCC potrebbe portare ad una migliore comprensione dei fenomeni di resistenza, metastasi e progressione, e aprire la strada a terapie più efficaci. Per lo studio preliminare sono state utilizzate tre linee cellulari di carcinoma a cellule squamose della lingua, UMSCC14B, UMSCC14A e UMSCC103, ottenute dall’Università del Michigan. Le cellule sono state coltivate sia in condizioni standard che sotto forma di floating sfere (FS) in mezzo privo di FBS e su piastre ultralow attachment, condizione selettiva per la crescita delle CSCs. Un primo esperimento di screening è stato effettuato tramite l’utilizzo di PCR array per geni correlati a staminalità e fenotipo metastatico. In tutte e tre le linee, le cellule cresciute come FS hanno mostrato maggiore espressione dei geni correlati a staminalità e metastasi. In seguito si è proceduto ad una caratterizzazione tramite citofluorimetria utilizzando markers cellulari correlati a staminalità, invasione e metastasi quali per esempio S-leX, CD44, ALDH, NCAM. Sulle tre linee considerate tutti i markers sono significativamente più espressi sulle sfere. A questo punto si è passati ad una prova di tumorigenicità in vivo iniettando sia le sfere che cellule standard in topi immunocompromessi, le sfere producono tumori più aggressivi e di dimensioni superiori. Inoltre le cellule derivate dalle sfere sono risultate essere resistenti sia al trattamento con  cisplatino che alle radiazioni rispetto alla controparte coltivata in condizioni standard, sia per citometria con il saggio annessina/PI sia attraverso il saggio di Colony forming Unit.

L’analisi delle tre linee cellulari ha evidenziato una deregolazione nella forma sfera di diversi microRNA implicati nella regolazione dell’apoptosi e del self-renewal, questo ci ha permesso di identificare un sub-set di miRNA la cui espressione è alterata nella forma sfera.

Un sicuro vantaggio dei miRNA  è legato al fatto che essi sono secreti in tutti i fluidi biologici dell’organismo compreso sangue e saliva e in essi hanno una stabilità elevata che ne permette la preservazione anche per più di 10 anni o in condizione di refrigerazione a -80°C o addirittura a temperatura ambiente sotto forma di spots su film di nitrocelluluosa. 

Questo permette da un lato di determinarne l’espressione in maniera incruenta o dal sangue dei pazienti o addirittura dalla saliva e dall’altro di effettuare studi retrospettivi su materiale biologico opportunamente preservato. La possibilità di utilizzare marcatori circolanti come fattori sia diagnostici che prognostici nelle malattie tumorali è di indubbio vantaggio in qnìuanto consente di effettuare monitoraggio sia popolazione sana (in caso dei marcatori diagnostici) che su popolazione affetta da neoplasia (in caso di marcatori prognostici e predittivi di risposta e di estensione di malattia) in maniera rapida e del tutto incruenta. Infatti la determinazione dei miRNA circolanti non necessita di un prelievo bioptico del tessuto tumorale, ma  richiede solo un prelievo di sangue o addirittura di saliva.

Procedura sperimentale e risultati preliminari

Nel corso degli ultimi 7 anni sono stati raccolti campioni tissutali (tessuto tumorale e controparte normale dello stesso paziente), saliva e siero di 220 pazienti sottoposti ad intervento di laringectomia e provenienti da diversi Centri Campani. Tali tessuto sono tutti criopreservati presso la bacma Biologica del Dipartimento di Medicina di Precisione della Università della Campania “L. Vanvitelli” e sono integrati da tutti i dati clinici e di follow up dei pazienti (sopravvivenza globale e libera da malattia, eventuali trattamenti concomitanti o successivi radianti e/o medici, recidiva, associazione con HPV, altre co-morbidità, etilismo, staging e grading della neoplasia, notizie anatomopatologiche complete e sito di origine della neoplasia). Impiegando una parte dei campioni raccolti nella bio-banca è stato già preliminarmente effettuato un array di 377 diversi miRNA a bassa densità (impiegando la Real Time PCR Technology, Life Technologies) su tessuto tumorale e normale e su siero di pazienti e di soggetti sani. Abbiamo anche stratificato i pazienti a seconda della presenza o meno di malattia linfonodale. Abbiamo utilizzato 5 gruppi diversi costituiti da pool di materiale biologico di 4 pazienti N+ o N- e abbiamo analizzato e comparato i dati.

Considerando la significatività statistica delle differenze rilevate abbiamo individuato 5 miRNA che sono candidati ad essere biomarcatori diagnostici tissutali di carcinoma laringeo:

miR-133b, miR-181a, miR-1, miR-140-3p, e miR-139-59.

I seguenti 5 miRNA sono stati individauti come candidati biomarcatori predittivi di presenza di malattia linfonodale: miR-449b, miR-449, miR-652, miR-362-3p, e miR-133b.

Analogamente, abbiamo rilevato alcuni miRNA nel siero che sono capaci di predire la presenza di malattia linfonodale (vedi tabella di sotto).

Inoltre, tra tutti i miRNA rilevabili nel siero o nei tessuti tumorali dei pazienti con carcinoma della laringe 14 erano presenti solo nel siero e 65 solo nei tessuti tumorali, mentre i rimanenti 76 erano espressi in entrambi.

Tali risultati suggerirebbero che i miRNA circolanti non sono necessariamente di origine tumorale, ma che la loro secrezione possa essere indotta dal tumore o in altre componenti cellulari del microambiente tumorale (per es.: cellule endoteliali, macrofagi e linfociti, fibroblasti associati al tumore) oppure in altri tessuti a distanza.

Con la metodica messa a punto presso i nostri laboratori è possibile rilevare la presenza di miRNA nella saliva di soggetti sani o affetti da neoplasia. In particolare 84 differenti miRNA sono determinabili nella saliva di donatori sani volontari i cui maggiormente espressi sono elencati nella tabella di sotto.

Conclusione

La validazione della deregolazione dei miRNA identificati, in tutte le linee cellulari di carcinoma testa collo a nostra disposizione e su un’ampia popolazione di pazienti affetti da carcinoma laringeo, ci consentira’ un loro impiego come importanti biomarcatori molecolari nello studio, nella diagnosi e nel trattamento del carcinoma della laringe. Inoltre ci proponiamo di allestire una banca biologica di DNA ed RNA derivante da tessuti e prelievi di sangue da pazienti affetti da carcinoma laringeo, al fine di analizzare l’espressione dei miRNA identificati nelle linee cellulari e procedere all’analisi di polimorfismi implicati nell’alterata espressione di miRNA e correlati alla sopravvivenza in questo tipo di tumori attraverso next generation sequencing technology.

Una linea di ricerca parallela sarà quella di studiare la rilevanza biologica dei miRNA trovati deregolati attraverso la transfezione di miRNA o antagomiRNA in linee cellulari di tumore laringeo. In particolare verranno valutati gli effetti della transfezione sulla regolazione della proliferazione, morte cellulare programmata e sui principali pathway di regolazione della crescita e metastatizzazione tumorale.

Autori

Filippo Ricciardiello, UOC di Otorinolaringoiatria AORN Cardarelli di Napoli
Michele Caraglia,  Dipartimento di Medicina di Precisione, Università della Campania “L. Vanvitelli”
Giuseppe Tortoriello, UOC di Otorinolaringoiatria Ospedale del Mare di Napoli ASL Napoli 1
Raffaele Addeo, UOC Oncologia, Ospedale “S. Giovanni di Dio” di Frattamaggiore, ASL Napoli2NORD
Giovanni Motta Clinica di Otorinolaringoiatria Università della Campania “L. Vanvitelli”
Gabriella Misso Dipartimento di Medicina di Precisione, Università della Campania “L. Vanvitelli”

23 Novembre 2022
Autore: 4287